增強(qiáng)恒溫?zé)晒釶CR檢測(cè)儀信號(hào)靈敏度可從優(yōu)化儀器硬件、調(diào)整檢測(cè)參數(shù)、改進(jìn)反應(yīng)體系及控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境等方面入手，具體技術(shù)路徑如下：

一、優(yōu)化儀器硬件：

選用高靈敏度探測(cè)器：可采用硅光電倍增管（SiPMT），其具有單分子級(jí)靈敏度，能將微弱熒光信號(hào)放大為可檢測(cè)電信號(hào)，也可選擇光電倍增管（PMT）或冷CCD成像系統(tǒng)，它們均有較高的光電轉(zhuǎn)換效率和信噪比，能有效捕捉微弱熒光信號(hào)。

優(yōu)化光源系統(tǒng)：采用LED光源，通過(guò)篩選特定波長(zhǎng)的芯片，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光基團(tuán)的精準(zhǔn)激發(fā)，減少對(duì)其他波長(zhǎng)熒光的干擾，還可通過(guò)脈沖調(diào)制或光強(qiáng)調(diào)節(jié)，與光電探測(cè)器形成協(xié)同，減少背景熒光的影響，增強(qiáng)特異性熒光信號(hào)的信噪比。

穩(wěn)定溫控系統(tǒng)：確保反應(yīng)區(qū)溫度均一性和準(zhǔn)確性，如使用加熱片控溫系統(tǒng)，將溫度均一性控制在±0.15℃，準(zhǔn)確性控制在±0.2℃，避免因溫度波動(dòng)影響擴(kuò)增效率，保證熒光信號(hào)的穩(wěn)定產(chǎn)生。

二、調(diào)整檢測(cè)參數(shù)：

調(diào)整熒光檢測(cè)增益值：在恒溫?zé)晒?/span>PCR檢測(cè)儀軟件中提高目標(biāo)熒光通道的增益，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，但需同時(shí)檢測(cè)空白對(duì)照，避免增益過(guò)高導(dǎo)致背景噪音增加。

延長(zhǎng)退火/延伸時(shí)間：針對(duì)低濃度模板，可將退火時(shí)間從30秒延長(zhǎng)至45-60秒，延伸時(shí)間從30秒延長(zhǎng)至60秒，增加模板與引物結(jié)合的概率，提高擴(kuò)增效率，從而增強(qiáng)信號(hào)。

增加循環(huán)數(shù)：對(duì)于低濃度樣本，可將常規(guī)的40個(gè)循環(huán)數(shù)增加至45-50個(gè)，但需設(shè)置陰性對(duì)照，排除非特異性擴(kuò)增累積對(duì)結(jié)果的影響。

三、改進(jìn)反應(yīng)體系：

優(yōu)化引物和探針：設(shè)計(jì)高度特異的引物，避免非特異性擴(kuò)增。選擇靈敏度高、分辨率好的熒光探針，如TaqMan MGB探針，熒光基團(tuán)可選用量子點(diǎn)或Alexa Fluor等強(qiáng)熒光分子，淬滅基團(tuán)用BHQ，同時(shí)將探針濃度優(yōu)化至0.2-0.4μM。

優(yōu)化試劑成分：選擇高效、穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，如SuperScriptⅡ、AMV和 Taq 酶等，并優(yōu)化dNTPs和Mg2?的濃度，以獲得良好的擴(kuò)增效果，也可在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入適量的甘油或DMSO等添加劑，提高逆轉(zhuǎn)錄效率。

控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境：將樣本制備區(qū)、反應(yīng)體系配置區(qū)、擴(kuò)增區(qū)分離，使用獨(dú)立移液器和耗材，如帶濾芯吸頭，減少氣溶膠、交叉污染等，也可在反應(yīng)體系中加入 UDG 酶和 dUTP，擴(kuò)增前37℃處理10分鐘，降解含dUTP的污染產(chǎn)物，降低背景信號(hào)對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。

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